Monitoring of Phenylalanine Levels in Patients with Phenylketonuria Using Dried Blood Spots: a Comparison of Two Methods

Abstract Phenylketonuria (PKU) is caused by deficient activity of phenylalanine hydroxylase (PAH), responsible for the conversion of phenylalanine (Phe) to tyrosine (Tyr). Monitoring of patients with PKU requires the measurement of Phe in plasma using high-performance liquid chromatography (HPLC) or in dried blood spots (DBS) using different techniques to adjust treatment strategy. The objective of this study was to evaluate Phe levels in DBS measured by two different methods and compare them with Phe levels measured in plasma by HPLC. We analyzed 89 blood samples from 47 PKU patients by two different methods: fluorometric method developed in-house (method A) and the commercially available PerkinElmer® Neonatal Phenylalanine Kit (method B) and in plasma by HPLC. The mean Phe levels by method A, method B, and HPLC were 430.4±39.9μmol/L, 439.3±35.4μmol/L, and 442.2±41.6μmol/L, respectively. The correlation values between HPLC and methods A and B were 0.990 and 0.974, respectively (p < 0.001 for both). Our data suggest that methods A and B are useful alternatives for monitoring Phe levels in patients with PKU, with method A being in closer agreement with the reference standard (HPLC).

The value of fasting in the diagnosis of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency / O valor do jejum no diagnóstico da deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia média

ABSTRACT Female patient carrier of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MCADD) with recurrent clinical episodes of hypoglycemia and altered level of consciousness, presented changes in blood acylcarnitine profile by tandem mass spectrometry and in the urinary organic acid analysis by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). This case demonstrates the importance of fasting prior biological sample collection (when possible) when MCADD is suspected, and emphasizes that the time/momentum of biological sample collection is crucial to diagnosis, considering the possibility that MCADD is underdiagnosed in Brazil.

RESUMEN Paciente portadora de deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCADD) con episodios clínicos recurrentes de hipoglucemia y alteración de consciencia presentó mudanzas en el perfil de acilcarnitinas en la sangre con técnicas de espectrometría de masas en tándem y en el análisis de ácidos orgánicos urinarios mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Este caso demuestra la importancia de la toma de muestras biológicas en ayunas (se posible) cuando se sospecha de MCADD y destaca que el tiempo/momento de extracción de la muestra biológica es valioso para el diagnóstico, considerando la posibilidad de que la MCADD es subdiagnosticada en Brasil.

RESUMO Paciente portadora de deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia média (MCADD), com episódios clínicos recorrentes de hipoglicemia e alteração de consciência, apresentou alterações no perfil de acilcarnitinas em sangue por espectrometria de massas em tandem e na análise de ácidos orgânicos urinários por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. Este caso demonstra a importância da coleta de amostra biológica em jejum (se possível) quando há suspeita de MCADD e ressalta que o tempo/momento de coleta da amostra biológica é importante para o diagnóstico, considerando a possibilidade de a MCADD ser subdiagnosticada no Brasil.

DNA damage in homocystinuria: 8-oxo-, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine levels in cystathionine-ß-synthase deficient patients and the in vitro protective effect of N-acetyl­L­cysteine

Introduction: Homocysteine (Hcy) tissue accumulation occurs in a metabolic disease characterized biochemically by cystathionine ß-synthase (CBS) deficiency and clinically by mental retardation, vascular problems, and skeletal abnormalities. Previous studies indicate the occurrence of DNA damage secondary to hyperhomocysteinemia and it was observed that DNA damage occurs in leukocytes from CBS-deficient patients. This study aimed to investigate whether an oxidative mechanism could be involved in DNA damage previously found and investigated the in vitro effect of N-acety-L-cysteine (NAC) on DNA damage caused by high Hcy levels. Methods: We evaluated a biomarker of oxidative DNA damage in the urine of CBS­deficient patients, as well as the in vitro effect of NAC on DNA damage caused by high levels of Hcy. Moreover, a biomarker of lipid oxidative damage was also measured in urine of CBS deficient patients. Results: There was an increase in parameters of DNA (8-oxo-7,8-dihydro-2'- deoxyguanosine) and lipid (15-F2t-isoprostanes levels) oxidative damage in CBS-deficient patients when compared to controls. In addition, a significant positive correlation was found between 15-F2t-isoprostanes levels and total Hcy concentrations. Besides, an in vitro protective effect of NAC at concentrations of 1 and 5 mM was observed on DNA damage caused by Hcy 50 µM and 200 µM. Additionally, we showed a decrease in sulfhydryl content in plasma from CBS-deficient patients when compared to controls. Discussion: These results demonstrated that DNA damage occurs by an oxidative mechanism in CBS deficiency together with lipid oxidative damage, highlighting the NAC beneficial action upon DNA oxidative process, contributing with a new treatment perspective of the patients affected by classic homocystinuria.

Mechanistic Bases of Neurotoxicity Provoked by Fatty Acids Accumulating in MCAD and LCHAD Deficiencies

Abstract Fatty acid oxidation defects (FAODs) are inherited metabolic disorders caused by deficiency of specific enzyme activities or transport proteins involved in the mitochondrial catabolism of fatty acids. Medium-chain fatty acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) and long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are relatively common FAOD biochemically characterized by tissue accumulation of medium-chain fatty acids and long-chain 3-hydroxy fatty acids and their carnitine derivatives, respectively. Patients with MCAD deficiency usually have episodic encephalopathic crises and liver biochemical alterations especially during crises of metabolic decompensation, whereas patients with LCHAD deficiency present severe hepatopathy, cardiomyopathy, and acute and/or progressive encephalopathy. Although neurological symptoms are common features, the underlying mechanisms responsible for the brain damage in these disorders are still under debate. In this context, energy deficiency due to defective fatty acid catabolism and hypoglycemia/hypoketonemia has been postulated to contribute to the pathophysiology of MCAD and LCHAD deficiencies. However, since energetic substrate supplementation is not able to reverse or prevent symptomatology in some patients, it is presumed that other pathogenetic mechanisms are implicated. Since worsening of clinical symptoms during crises is accompanied by significant increases in the concentrations of the accumulating fatty acids, it is conceivable that these compounds may be potentially neurotoxic. We will briefly summarize the current knowledge obtained from patients with these disorders, as well as from animal studies demonstrating deleterious effects of the major fatty acids accumulating in MCAD and LCHAD deficiencies, indicating that disruption of mitochondrial energy, redox, and calcium homeostasis is involved in the pathophysiology of the cerebral damage in these diseases. It is presumed that these findings based on the mechanistic toxic effects of fatty acids may offer new therapeutic perspectives for patients affected by these disorders.

Acidúrias orgânicas: diagnóstico em pacientes de alto risco no Brasil / Organic aciduria: diagnosis in high-risk brazilian patients

Objetivo: o objetivo deste trabalho foi ode verificar a prevalência das acidúrias orgânicas em pacientes brasileiros de alto risco. Métodos: técnicas laboratoriais para a detecção e quantificação de ácidos orgânicos por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa foram implantadas em Porto Alegre, Brasil. Foram analisados 1.480 pacientes suspeitos, investigados entre janeiro de 1994 e junho de 2000. Resultados: foram diagnosticados 73 (4,9 por cento) casos de acidemias (acidúrias) orgânicas entre os indivíduos testados. Na maioria desses pacientes a terapia resultou em rápida melhora na sua sintomatologia, distintamente de nossos casos previamente diagnosticados em outros laboratórios na Europa e nos Estados Unidos, quando muitos pacientes faleciam antes que quaisquer medidas pudessem ser tomadas. Conclusões: estes resultados mostram a importância de diagnosticar as acidúrias orgânicas in loco mesmo em países em desenvolvimento, apesar dos custos extras envolvidos

Clinical and biochemical findings in 7 patients with X-linked adrenoleukodystrophy treated with Lorenzo's Oil

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é uma desordem hereditária do metabolismo peroxissomal, bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa ("very long chain fatty acids"- VLCFA) em diferentes tecidos e em fluidos biológicos, sendo os principais ácidos acumulados o hexacosanóico (C26:0) e o tetracosanóico (C24:0). O acúmulo destes ácidos graxos está associado com esmielinizaçäo cerebral e insuficiência adrenal. A incidência desta condiçäo é estimada em 1 para 25.000 em homens. Pelo menos seis fenótipos podem ser distinguidos, sendo a adrenoleucodistrofia (ALD) cerebral infantil e a adrenomieloneuropatia (AMN) os mais comuns. O tratamento preconizado consiste na utilização da mistura gliceroltrioleato/gliceroltrierucato (GTO/GTE), conhecida como Óleo de Lorenzo, combinada com dieta pobre em VLCFA. Existem ainda, terapias alternativas como transplante de medula óssea e imunossupressäo, além da utilizaçäo de lovastatina e fenilacetato de sódio. Neste trabalho fez-se uma avaliaçäo do tratamento com Óleo de Lorenzo associado à dieta restrita em VLCFA de 7 pacientes homens com X-ALD analisando a evoluçäo clínica e bioquímica. Os pacientes apresentaram uma reduçäo média de 50 por cento nos valores de C26:0 e de 42,8 por cento na razäo C26:0/C22:0 após o início do tratamento. A maioria dos pacientes permaneceu clinicamente bem e aproximadamente 30 por cento dos pacientes apresentaram uma progressäo rápida no curso clínico da doença. Parece näo haver uma clara correlaçäo bioquímico-clínica do tratamento. Os resultados nos mostram que novas terapias mais eficazes para X-ALD säo necessárias para que se possa obter um melhor prognóstico da doença com progressäo mais lenta dos sintomas apresentados ou mesmo reversäo dos sintomas já presentes nos pacientes.

Aplicação de um protocolo clínico-laboratorial para identificação de erros inatos do metabolismo em crianças gravemente enfermas / Application of a clinical and laboratorial protocol of investigation of inborn errors of metabolism among critically ill children

Objetivo: O objetivo deste trabalho foi aplicar um protocolo para investigação de Erros Inatos do Metabolismo (EIM) em crianças gravemente enfermas. Métodos: Trata-se de um estudo transversal envolvendo 46 crianças com suspeita de um distúrbio metabólico, selecionadas, ao longo de dois anos, a partir de solicitações de investigação de EIM procedentes de Unidades de Tratamento Intensivo pediátricas ou neonatais da região metropolitana de Porto Alegre. Foram incluídos pacientes que apresentavam uma ou mais das seguintes alterações clínicas, sem etiologia definida: acidose metabólica, desequilíbrio hidroeletrolítico, hipoglicemia, convulsões, alteração de consciência, alteração hepatica ou história familiar sugestiva de um EIM. O protocolo constou de avaliação clínica, testes obrigatórios (realizados em todos os pacientes) e testes opcionais (realizados seletivamente de acordo com o resultado dos primeiros ou a partir de uma hipótese clínica específica). Resultados: Foram identificados 6 casos de EIM nos 46 pacientes investigados (13 por cento): galactosemia clássica, hiperglicinemia não cetótica, acidúria propiônica, acidúria isovalérica, acidúria 3-hidroxi-3-metil-glutárica e deficiência de 2-metil-acetoacetilCoAtiolase. Assim, a freqüência de acidúrias orgânicas neste grupo foi de 4/46 (8,7 por cento). Conclusões: A freqüência de acidúrias orgânicas justifica a inclusão da pesquisa de ácidos orgânicos entre os exames de primeira linha nas crianças com quadros agudos e graves sem etiologia definitiva. A freqüência realtivamente elevada de EIM, numa proporção comparável à observada em grupos de alto risco, indica que o protocolo é eficiente e justifica a investigação sistemática de EIM em crianças com quadros agudos e graves sem etiologia claramente definida

Detection of metabolic disorders in high-risk patients: a pilot study in Salvador, Bahia

The purpose of this pilot-study was to evaluate the applicability of a screening protocol for the detection of inborn errors of metabolism (IEM) in high-risk patients. The protocol was applied in 65 patients referred to the Medical Genetics Laboratory of the University Hospital Professor Edgard Santos due to the suspicion of an IEM. Eight of these patients (12.3 percent) displayed an abnormal result in the screening protocol. These patients, along with 22 who displayed normal results in the screening protocol but who presented clinical symptoms or signs suggestive of an IEM not detectable by the tests applied, were selected for a further diagnostic investigation. In 5 of these 30 patients (7.7 percent of the total sample) it was possible to establish the diagnosis of an specific IEM. The results indicate that the designed screening protocol was sucessfully applied, allowing the detection of affected patients in a frequency comparable to that observed in larger studies performed elsewhere. The continuation of this study and the enlargement of the sample will help to delineate the profile of IEM in northeast of Brazil and will allow the identification of a significative number of patients and families. who could benefit from the therapeutic and preventive measures available for these diseases.

Effect of mevalonate on in vitro reactivity of human lymphocytes stimulated by phytohemagglutinin, concanavalin A and pokeweed mitogen

Patients with mevalonic aciduria accumulate mevalonate in their and present unexplained crises of fever, lymphadenopathy, edema and mucocutaneous manifestations. In the present study, we investigated the action of mevalonate on in vitro proliferation of human lymphocytes unstimulated and stimulated by phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (Con A) and pokeweed mitogen (PWM) in order to assess possible immunomodulatory activities which could explain these symptoms. The mitogen-induced lymphocyte response was evaluated from the extent of the incorporation of 3H-thymidine into cellular DNA in vitro. Our results show that mevalonate in doses up to 5 mM does not affect human lymphocyte transformation. Furthermore, mevalonate does not reverse the suppression of lymphocyte blastogenesis caused by cortisol (100 ng/ml). These results indicate that this compound or its metabolites do not affect directly lymphocyte responsiveness.

Methylmalonic aciduria unresponsive to vitamin B12: description of two cases and prenatal diagnosis in a brazilian family

Metilmalonicacidúria secundária à deficiência da mutase da metilmalonil CoA foi diagnosticada em duas crianças filhas de pais näo consangüíneos. A primeira criança morreu um dia antes que o diagnóstico correto fosse feito. Nesse período, sua mäe estava no terceiro trimestre de gestaçäo. Os níveis urinários de ácido metilmalônico foram medidos ao longo do terceiro trimestre de gestaçäo, mostrando um aumento gradual e indicando a presença de um feto homozigoto para a doença. A presença de metilmalonicacidúria foi confirmada no recém-nascido e o tratamento pode ser começado precocemente. A criança está sendo tratada com uma dieta com pouca proteína, com suplementaçäo de uma mistura de aminoácidos (exceto treonina, metionina, valina e isoleucina), DL-carnitina e bicarbonato. Está no momento fisicamente e mentalmente normal com doze meses de idade

Conduta nos defeitos do tubo neural / Management in neural tube defects

A conduta frente a uma família onde ocorreu o nascimento de uma criança afetada por um defeito do tubo neural (anencefalia, espinha bífida, etc) tem sofrido sensíveis mudanças nos últimos anos. Inicialmente o único instrumento disponível era o aconselhamento genético baseado nos dados epidemiológicos descritos na literatura. Com o advento do diagnóstico pré-natal desses distúrbios através da quantificaçäo de alfafetoproteína no sangue materno e líquido amniótico, o diagnóstico preciso desses defeitos no 2§ trimestre de gestaçäo possibilitou que se oferecesse o aborto terapêutico. Nos últimos 3 anos, demonstrou-se que a suplementaçäo diária de 4mg de ácido fólico a mulheres que tiveram afetados com esses defeitos e que desejavam procriar novamente, por um período compreendido entre um mês antes da concepçäo até a segunda falha menstrual diminui o risco de recurrência em até 10 vezes e, portanto, é uma nova e útil medida a ser adotada pelo obstetra no manejo dessa situaçäo

Inhibition of lymphocyte blastogenesis by serum of gravid women: lack of correlation between in vitro immunosuppresion and alpha-feto-protein levels

A proliferaçäo in vitro de linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (Con A), pokeweed mitogênio (PWM) e por células alogênicas em culturas mistas unidirecionais de linfócitos, na presença de soros de mulheres grávidas e näo grávidas, foi determinada pela incorporaçäo de timidina triciada pelo DNA celular.A proliferaçäo linfocitária, independentemente do estímulo empregado, foi menor nas culturas contendo soro de gestantes, indicando propriedades supressoras inespecíficas nesses mesmos soros. Além disso, essa inibiçäo era progressivamente maior em soros de pacientes com idade gestacional avançada. Nenhuma correlaçäo verdadeira foi encontrada entre as propriedades inibitórias dos soros e suas concentraçöes de alfafetoproteína (AFP), o que sugere que a proteína näo é o principal fator responsável pela imunossupressäo in vitro causada por soro materno

Human purified alpha-fetoprotein: I. In vitro effects on lymphocyte proliferation to mitogens and on mixed lymphocyte reactivity

Estudou-se o efeito de alfafetoproteína (AFP) sobre a proliferaçäo de linfócitos periféricos humanos estimulados por fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (Con A), pokeweed mitogênio (PWM) e por células alogênicas em culturas mistas de linfócitos, ao medir-se e comparar-se a incorporaçäo de timidina triciada (parâmetros de crescimento celular) em culturas contendo AFP humanas purificada e em culturas sem a proteína (controles). Nenhuma alteraçäo quantitativa na reatividade linfocitária foi verificada nas culturas com AFP

The influence of aldosterone on the phytohemagglutinin - induced human lymphocyte blastogenesis

Este trabalho investigou a capacidade da aldosterona, cuja concentraçäo no sangue de mulheres grávidas está aumentada em até 10 vezes quando comparada com os níveis séricos em mulheres näo grávidas, em inibir a proliferaçäo in vitro de linfócitos periféricos humanos estimulados por fitohemaglutinina (PHA), medida através da incorporaçäo de timidina triciada pelo DNA celular. As doses de aldosterona utilizadas nas culturas de linfócitos foram aquelas existentes em soros de mulheres näo grávidas, em soros de mulheres grávidas no final da gestaçäo e dose duas vezes maiores que essas últimas. Três concentraçöes diferentes de PHA, subótimas, ótimas e supraótimas, foram usadas nos testes. O hormônio e o mitogênio foram adicionados no início das incubaçöes. Nossos resultados mostraram que aldosterona nas doses acima referidas näo tem qualquer efeito sobre a proliferaçäo de linfócitos estimulados por PHA. Além disso, foi também demonstrado que incubaçäo prévia dos linfócitos com aldosterona por 24 horas, que faz as células reexpressarem receptores para outros hormônios, seguida da adiçäo do mitogênio, näo provoca qualquer efeito da aldosterona sobre este teste in vitro de imunidade mediada por células

Síndrome de Ellis van Creveld: descriçäo de um caso / Ellis van Creveld syndrome: a case report

A incidência de portadores de síndromes genéticas mal-definidas em hospitais materno-infantis é relativamente alta. O presente relato descreve um caso típico de síndrome de Ellis van Creveld e enfatiza a importância do diagnóstico correto do mesmo

Inborn metabolic errors in visually deficient patients: efficiency of screening methods

Diversos erros inatos do metabolismo, entre os quais a galactosemia, a homocistinúria, a doença de Lowe, as mucopolissacaridoses e as dislipidoses, podem levar à deficiência visual. A detecçäo desses distúrbios permite, em determinados casos, que afetados e familiares se beneficiem de medidas preventivas e/ou terapêuticas. Visando à identificaçäo de distúrbios metabólicos, 160 deficientes visuais foram estudados através de inúmeras técnicas bioquímicas de triagem e diagnóstico. Com o objetivo de testar a eficiência dos métodos de triagem empregados, 71 desses pacientes foram submetidos a uma reavaliaçäo cuidadosa. Em nenhum dos estudos foi detectados um erro inato do metabolismo relacionado com deficiência visual. Na avaliaçäo inicial foi identificado um caso de cistinúria. Na reavaliaçäo, esse diagnóstico foi confirmado e foram detectados distúrbios metabólicos intermitentes (glicosúria renal e frutosúria essencial) em 2 pacientes. Esses resultados indicam que a prevalência de erros inatos do metabolismo que têm manifestaçöes oculares é baixa em deficientes visuais, e que a triagem rotineira é eficiente para a detecçäo de anormalidades metabólicas persistentes